论文易--专业学术论文全方位服务机构,10年积淀,30000名职称用户放心的选择!

论文易

您当前的位置: 论文范文 > 医学论文 > 临床医学论文 > 正文

长链非编码RNA SUMO1P3对人肝癌HepG2细胞恶性生物学行为的影响

  目的 探讨长链非编码RNA SUMO1P3对人肝癌HepG2细胞恶性生物学行为的影响。 方法 收集40例来自武汉大学人民医院肝癌患者手术后肝癌及其癌旁组织标本,人肝癌细胞系和正常肝细胞由武汉大学人民医院中心实验室保存。采用实时荧光定量PCR技术(RT-PCR)检测SUMO1P3在肝癌及癌旁组织、肝癌细胞及正常肝细胞中表达情况。实验分为si-NC组和si-SUMO1P3组,应用小干扰RNA(siRNA)转染HepG2细胞,分别以CCK8法、流式细胞术、划痕实验及Transwell侵袭实验检测下调SUMO1P3对HepG2细胞增殖、凋亡及侵袭转移的影响。 结果 SUMO1P3在肝癌组织中较对应的癌旁组织显著高表达(P < 0.05);SUMO1P3在肝癌细胞株中较正常肝细胞显著高表达(P < 0.05)。肝癌细胞转染48 h后si-SUMO1P3组较si-NC组SUMO1P3表达明显下调(P < 0.05);CCK8实验显示,si-SUMO1P3组转染24、48、72、96 h后吸光度值均低于si-NC组(P < 0.05);流式细胞术显示,si-SUMO1P3组细胞凋亡率高于si-NC组(P < 0.05);划痕实验证明,si-SUMO1P3组细胞迁移抑制率高于si-NC组(P < 0.05);Transwell实验表明,si-SUMO1P3组穿膜细胞数明显少于si-NC组(P < 0.05)。 结论 LncRNA SUMO1P3可能与肝癌细胞的增殖、凋亡及侵袭转移等生物学行为密切相关。 
  [关键词] 肝癌;长链非编RNA;SUMO1P3;生物学行为 
  [中图分类号] R735.7 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721(2016)08(c)-0031-05 
  [Abstract] Objective To explore the effects of LncRNA SUMO1P3>  [Key words] Hepatocellular carcinoma; Long non-coding RNA; SUMO1P3; Biology behaviors 
  原发性肝癌是常见的消化道肿瘤,发病率和死亡率高,目前亟需寻找早期诊断和有效治疗肝癌的新方法[1]。长链非编RNA(Long noncoding RNA,LncRNA)是一种转录本大于200个核苷酸的RNA,可以通过表观遗传、转录及转录后调控等方式参与疾病的发生[2]。研究证实,某些lncRNA在肿瘤的表达水平会发生特异性改变,可以作为诊断癌症的标志物和潜在的药物作用靶点[3-4]。已有文献报道lncRNA SUMO1P3在胃癌、膀胱癌中显著高表达,且能够影响肿瘤细胞的增殖、凋亡及侵袭转移[5-6]。本研究检测肝癌组织和肝癌细胞中SUMO1P3表达水平,使用小干扰RNA技术下调肝癌细胞株HepG2中SUMO1P3的表达,验证其对肝癌细胞生物学行为的影响,为肝癌诊断和治疗提供依据。 
  1 材料与方法 
  1.1 组织、细胞和主要试剂 
  肝癌及其癌旁组织标本来自武汉大学人民医院手术肝癌患者。人肝癌细胞和正常肝细胞由武汉大学人民医院中心实验室保存。SUMO1P3引物为5′-GAACTGGGAATGGAGGAAGA-3′和 5′-TGAGAAAGGATTGAGGGAAA-3′,购自武汉巴菲尔生物公司。SUMO1P3小干扰RNA(siRNA)购自广州市锐博生物公司,序列:5′-TGGCCCTGATGTTCTAGCATGTGAT-3′。 
  1.2 细胞培养、转染及分组 
  HepG2细胞加入5 mL RPMI 1640培养液,放于5%CO2、37℃恒温细胞培养箱中进行培养。选取生长状态良好的细胞,以5×105个/孔的密度接种于6孔板,待细胞生长到60%~80%融合时使用无血清培养液进行转染。转染后6 h换成含10%胎牛血清的培养液继续培养。分为si-NC组和si-SUMO1P3组。 
  1.3 CCK8法绘制细胞生长曲线 
  将各组HepG2细胞分别以4×103个/孔接种于96孔板,转染后0、24、48、72、96 h每组取6孔,加入CCK8 10 μL/100 μL,37℃培养2 h后用全波段酶标仪检测波长450 nm处的吸光度(A)值。 
  1.4 流式细胞仪检测细胞凋亡 
  在转染后48 h的HepG2中加入500 μL缓冲液,5 μL Annexin V-FITC和10 μL的PI混匀,使用流式细胞仪测定细胞凋亡率。 
  1.5 划痕实验 
  用10 μL白色枪头在转染后的6孔板细胞底面进行划痕,加入无血清1640培养基继续培养,在0 h和24 h照相,测各组划痕宽度,取平均值计算迁移抑制率。 
  1.6 Transwell侵袭实验 
  Transwell上室铺用Matrigel基质胶600 μL,将200 μL转染后的细胞悬液(5×104/L)加入上室,下室加600 μL低血清的培养液培养24 h。结晶紫染色30 min后在显微镜下拍照,最终以穿膜细胞的数目代表HepG2细胞的侵袭能力。 
  1.7 统计学方法 
  采用SPSS 20.0统计学软件进行数据分析,计量资料数据用均数±标准差(x±s)表示,两组间比较采用t检验;以P < 0.05为差异有统计学意义。 
  2 结果 
  2.1 LncRNASUMO1P3在肝癌组织和肝癌细胞株中表达情况 
  采用RT-PCR技术检测40例肝癌与癌旁标本SUMO1P3表达水平,发现40对标本中有29对(72.5%,29/40)标本中肝癌比癌旁组织SUMO1P3高表达,肝癌和癌旁组织SUMO1P3表达差异有统计学意义(P < 0.05)(图1)。培养人肝癌细胞系和正常肝细胞,使用RT-PCR技术检测SUMO1P3表达水平,发现其在肝癌细胞系中显著高表达(图2),其中在HepG2细胞中表达最高,故后续实验选择使用HepG2细胞。 
  2.2 siRNA对肝癌细胞内SUMO1P3表达的影响 
  在肝癌细胞株HepG2中进行siRNA转染,si-SUMO1P3组细胞内SUMO1P3表达降低,为si-NC组的(24.33±3.15)%,两组差异有统计学意义(t =25.01,P < 0.05),见图3。表明转染SUMO1P3 siRNA可下调HepG2细胞内SUMO1P3的表达。 
  2.3 下调SUMO1P3对细胞增殖的影响 
  转染siRNA SUMO1P3后,HepG2细胞的生长明显受到抑制,见图4。转染24、48、72、96 h后,si-NC组吸光度值分别为(0.5117±0.0035)、(1.0336±0.0097)、(1.3263±0.0081)、(1.6853±0.0073);si-SUMO1P3组吸光度值分别为(0.4533±0.0041)、(0.8446±0.0065)、(1.0512±0.0096)、(1.2363±0.0102);两组吸光度值比较差异均有统计学意义(P < 0.05)。 
  2.4 下调SUMO1P3对细胞凋亡的影响 
  转染48 h后,流式细胞术测得si-NC组细胞凋亡率为(13.59±1.36)%,si-SUMO1P3组细胞凋亡率为(38.28±3.41)%,两组比较差异有统计学意义(P < 0.05),见图5。 
  2.5 下调SUMO1P3对细胞迁移的影响 
  转染48 h,si-NC组细胞划痕迁移率为(13.69±0.15)%,si-SUMO1P3组细胞划痕迁移率为(36.92±0.43)%,两组比较差异有统计学意义(P < 0.05),见图6。 2.6 下调 SUMO1P3对细胞侵袭的影响 
  转染48 h后,si-NC组细胞穿膜个数为(119.00±8.53)个,si-SUMO1P3组细胞穿膜个数为(54.00±7.12)个,两组比较差异有统计学意义(P < 0.05),见图7。 
  3 讨论 
  原发性肝癌是人类常见的恶性肿瘤,其目前的治疗手段有手术切除、放化疗、靶向治疗及生物治疗等[7],但由于肝癌发现时大多已属于晚期,治疗效果不理想,总体5年生存率较低[8]。LncRNA是长度大于200个核苷酸的非编码RNA,是RNA聚合酶Ⅱ转录的副产物,起初被认为是基因组转录的“噪音”,不具有生物学功能[9]。然而,大量研究表明,lncRNA参与了X染色体沉默、基因组印记以及染色质修饰[10]、转录激活、转录干扰等多种重要的调控过程[11]。已有一些lncRNA被证明可作为肝癌的标志物或预后因子[12],如肝癌高表达基因(HULC)[13]、同源异形盒基因(HOX)转录反义RNA(HOTAIR)[14]、肺腺癌转移相关转录子1(MALATl)[15]、母系表达基因3(MEG3)[16]、H19等[17]。LncRNA种类繁多,作用方式多样化,近期研究发现LincRNA UFC1能够通过结合稳定HuR mRNA从而活化β-Catenin,抑制肝癌细胞增殖[18]。LncRNA-ATB在被TGF-β活化后可以促进EMT发生,进而促进肝癌细胞侵袭转移[19]。而LncRNA-HOTAIR通过下调SETD2能够促进肝癌肿瘤干细胞增殖,导致化疗耐药的发生[20]。即使如此,当前关于LncRNA在原发性肝癌中的认知仍然非常有限。 
  SUMO1P3是小泛素样修饰蛋白1假基因3(small ubiquitin-like modifier 1 pseudogene 3)。已被证实SUMO1P3在胃癌组织中较对应的癌旁组织显著高表达,其表达水平与肿瘤大小、组织分化、淋巴结转移和侵袭等临床病理特征相关,表明SUMO1P3有可能是胃癌诊断的标志物之一[5]。Zhan等[6]研究证实,SUMO1P3在膀胱癌组织显著高表达,表达水平与组织分级和TNM分期相关,在膀胱癌细胞中下调SUMO1P3能够抑制癌细胞增殖和侵袭,促进癌细胞凋亡。目前尚无关于SUMO1P3在肝癌中的研究。本研究利用RNA干扰技术干扰肝癌HepG2细胞中SUMO1P3的表达,可见下调SUMO1P3能显著抑制HepG2细胞的增殖和侵袭转移,并促进细胞凋亡,提示内源性SUMO1P3在肝癌细胞恶性生物学行为中起着关键作用,SUMO1P3可能成为肝癌诊断和预后的监测指标及治疗靶点。 
  综上所述,SUMO1P3与肝癌的发生、发展及转移密切相关,干扰SUMO1P3的表达可抑制肝癌细胞的增殖和侵袭转移,并促进细胞凋亡,相关的调控机制还有待进一步研究证实。 
  [参考文献] 
  [1] Laursen L. A preventable cancer[J]. Nature,2014,516(7529):S2-3. 
  [2] Harries LW. Long non-coding RNAs and human disease[J]. Biochem Soc Trans,2012,40(4):902-906. 
  [3] Zou H,Shao CX,Zhou QY,et al. The role of lncRNAs in hepatocellular carcinoma:opportunities as novel targets for pharmacological intervention [J]. Expert Rev Gastroenterol Hepatol,2016,10(3):331-340. 
  [4] Wang J,Sun J,Wang J,et al. Long noncoding RNAs in gastric cancer: functions and clinical applications [J]. />  [5] Mei D,Song H,Wang K,et al. Up-regulation of SUMO1 pseudogene 3(SUMO1P3)in gastric cancer and its clinical association [J]. Med />  [6] Zhan Y,Liu Y,Wang C,et al. Increased expression of SUMO1P3 predicts poor prognosis and promotes tumor growth and metastasis in bladder cancer [J]. />  [7] Li C,Chen J,Zhang K,et al. Progress and Prospects of Long Noncoding RNAs(lncRNAs)in Hepatocellular Carcinoma [J]. Cell Physiol Biochem,2015,36(2):423-434. 
  [8] Zhao J,Greene CM,Gray SG,et al. Long noncoding RNAs in liver cancer [J]. Expert Opin Ther Targets,2014,18(10):1207-1218. 
  [9] Huang JL,Zheng L,Hu YW,et al. Characteristics of long non-coding RNA and its relation to hepatocellular carcinoma [J]. Carcinogenesis,2014,35(3):507-514.

客服中心

电话:400-8813-556

投稿:lunwenwww@qq.com

咨询部:

发表部:

指导部:

关于我们 | 案例展示 | 抄袭检测 | 论文发表服务 | 支付平台 | 常见问题